Ribo-seq簡介

Ribo-seq（Ribosome Profiling，核糖體印跡測序，翻譯組測序），通過識別與核糖體結合的mRNA，對正在翻譯的RNA片段（即核糖體保護片段，Ribosome Protect Fragments, RPFs）進行捕獲和測序分析。其核心原理是利用低濃度RNase處理核糖體-新生肽鏈復合物時，未被核糖體覆蓋的mRNA會被降解，而被核糖體保護的約28~30bp的RNA小片段，即核糖體足跡（ribosome footprints，RFP）得以保留。

Ribo-seq技術的革命性突破在于它能夠通過高通量測序解析RPFs的位置和序列，可精確定位活細胞中正在翻譯的核糖體在RNA上的具體位置，并可幫助研究人員推斷起始密碼子、識別上游開放閱讀框（uORFs）、解析密碼子翻譯動態等信息。

在神經科學領域，基因表達調控研究長期聚焦于轉錄水平，然而越來越多的證據表明，翻譯調控在突觸可塑性、神經元分化及認知記憶形成中扮演關鍵角色（例如，神經元受刺激后突觸局部的mRNA翻譯動態直接影響突觸強度變化）。作為連接轉錄組與蛋白質組的橋梁，Ribo-seq精準揭示了神經系統中蛋白質合成的調控機制。

Ribo-seq研究思路

通過系統梳理Ribo-seq相關研究文獻，我們將其核心研究思路歸納為四大方向：精準量化翻譯效率，解碼多維調控因子，挖掘潛在翻譯元件，聯合解析分子機制（如下圖所示），本期推文我們將分別介紹這四種研究思路及其在神經科學方向的應用。

一：精準量化翻譯效率：破解“轉錄-翻譯"脫鉤之謎

Ribo-seq通過捕獲核糖體保護的mRNA片段（RPFs），與RNA-seq數據聯合分析可計算基因的翻譯效率（Translational Efficiency, TE），計算公式為：TE=Ribo-seq豐度/RNA-seq豐度。這一指標直接反映了單位mRNA的翻譯活性，是基因在翻譯水平調控強度的直觀體現。

TE的價值在于它能揭示不依賴于轉錄水平的翻譯調控——即使mRNA總量不變，通過調控核糖體結合效率（如eIF2α磷酸化抑制翻譯起始），TE也可顯著改變蛋白質合成量。這種“翻譯效率調控"正是解答“基因如何在翻譯水平實現精準表達調控"的核心鑰匙，例如在神經元受刺激后，突觸局部mRNA的TE可在分鐘內激增，快速響應神經信號而不依賴新基因的轉錄。

文獻分享：通過Ribo-seq精準量化翻譯效率，聚焦亨廷頓病（HD）中線粒體翻譯缺陷的機制解析

文章標題：Ribosome Profiling and Mass Spectrometry Reveal Widespread Mitochondrial Translation Defects in a Striatal Cell Model of Huntington Disease

研究背景：亨廷頓病 (Huntington's disease, HD) 是一種由亨廷頓基因 (huntingtin, HTT) 中的多重復glutamine序列擴展引起的神經退行性疾病。該病以紋狀體異常、認知和精神障礙以及舞蹈樣運動為特征。線粒體是一個擁有半自主系統的細胞器，有自己的基因表達和mRNA翻譯機制，其功能依賴于核基因組與線粒體基因組（mtDNA）的協同調控。人類線粒體基因組 (mtDNA) 包含37個蛋白編碼基因，包括2個rRNA基因和22個tRNA基因，以及13個氧化磷酸化 (OXPHOS) 反應相關復合物 (I、III和IV) 的編碼基因。而mtDNA維護、復制、轉錄、翻譯、翻譯后修飾、運輸、組裝和OXPHOS復合物(II和V)表達所需的基因均由細胞核編碼。因此，這種雙基因組調控模式使得線粒體功能的研究頗具挑戰，特別是OXPHOS復合物的翻譯和組裝，因為這些復合物是由不同的基因組編碼的。已有研究表明HD與紋狀體線粒體功能障礙相關，但mtDNA編碼mRNA的翻譯效率在HD中的變化規律及調控機制尚不清楚。

該研究使用小鼠紋狀體細胞模型，包括野生型HTT（Control）、雜合突變型HTT（HD-het）和純合突變HTT（HD-homo）的細胞系。通過Ribo-Seq分析線粒體編碼的mRNA轉錄本上的核糖體占用情況。結合TMT-MS技術對成熟線粒體蛋白組進行定量分析，旨在揭示HD中mtDNA翻譯調控與線粒體功能障礙的因果關系。

研究發現：

研究結論：該研究通過Ribo-seq/質譜雙模態量化，揭示亨廷頓病中“核糖體滯留卻蛋白荒廢"的線粒體翻譯悖論，提供了HD中線粒體翻譯缺陷的證據，揭示了線粒體翻譯調控的復雜性。發現的翻譯失調可能對HD的發病機制有重要影響，為未來的治療干預提供了新的視角。

二：解碼多維調控機制：捕捉翻譯“調速器"

通過TE（翻譯效率）值，我們獲知了基因的翻譯調控變化。那是什么導致了基因的翻譯調控發生顯著變化？Ribo-seq可解析非經典翻譯調控元件（如uORF、IRES、核糖體滯留位點）對翻譯速率的影響，揭示RNA結構、RNA結合蛋白（RBPs）或修飾如何動態調控神經基因的翻譯起始/延伸效率。

文獻分享：精神分裂癥的翻譯剎車失靈：miR-1271-5p缺失引發突觸蛋白失控合成

文章標題：Characterising the Transcriptional and Translational lmpact of the Schizophrenia-Associated miR-1271-5p in Neuronal cells

研究背景：作者在之前的miRNA-seq分析結果中發現，miR-1271-5p是一種與精神分裂癥有關，且在神經元中表達的miRNA，但目前miR-1271-5p這一miRNA的作用機制并不明晰。

研究目的：利用RNA-seq、Ribo-seq研究miR-1271-5p在神經元中的作用機制和功能。

研究發現：

研究結論：miR-1271-5p作為翻譯“剎車器"，通過結合靶基因3'UTR直接抑制核糖體起始（非降解mRNA），其失靈導致突觸蛋白失控合成。該研究不僅揭示精神分裂癥的翻譯調控新機制，更提供了靶向RNA的精準干預思路。

三：挖掘潛在翻譯元件：掃描基因組的“暗物質"

傳統基因注釋體系往往忽略非典型翻譯事件，而Ribo-seq憑借其高分辨率的核糖體足跡分析，可在全基因組范圍內揭示新型翻譯元件：

sORF（小開放閱讀框）：多位于mRNA非編碼區（如5’ UTR）或長鏈非編碼RNA中，編碼微蛋白（<100個氨基酸）。

circRNA（環狀RNA）：部分含內部核糖體進入位點（IRES）的circRNA可啟動翻譯，具有翻譯潛力。

lncRNA（長鏈非編碼RNA）：傳統定義為非編碼RNA，但Ribo-seq證實部分lncRNA含隱蔽sORF。

這些曾被視為“基因組暗物質"的翻譯元件，在神經系統中可能具有特殊功能，參與神經發育、突觸可塑性和神經退行性過程。

文獻分享：人腦翻譯組圖譜破譯：38,000個隱藏微蛋白揭示神經發育新維度

文章標題：Developmental Dynamics of RNA Translation in the Human Brain

研究背景：基因表達調控對神經發育、可塑性及認知功能至關重要，雖已有研究剖析發育中人腦的轉錄情況，但對伴隨的翻譯調控認知存在缺口。核糖體分析顯示，酵母、心臟及腫瘤組織中先前未知的小開放閱讀框（sORFs）可編碼微蛋白并發揮重要調控作用，然而類似微蛋白在發育中人腦的性質和作用幾乎未被表征。

研究材料：30個產前大腦皮質樣本和43個成人大腦樣本；人胚胎干細胞（hESC）衍生的神經元細胞

研究發現：

研究結論:該研究深入探討了人類大腦發育過程中RNA翻譯的動態變化。聯合使用核糖體印跡測序（Ribo-seq）和RNA測序（RNA-seq）技術繪制了人類大腦的翻譯圖譜，揭示了基因表達調控的關鍵節點，并識別了數千個之前未知的翻譯事件，包括產生人類大腦特異性微蛋白（microproteins）的小開放閱讀框（sORFs）。

四：聯合解析分子機制：整合多組學破解翻譯調控的因果鏈條

Ribo-seq的強大功能在與其他組學技術整合時更為顯著：

翻譯組+表觀轉錄組（如 m6A-seq）：揭示RNA修飾對翻譯的動態調控。

翻譯組+蛋白質組（TMT-MS/Label-free）：不僅能驗證翻譯效率（TE）與蛋白質豐度的一致性，更能發現翻譯后調控的 “盲區"。

翻譯組+代謝組（LC-MS 代謝物檢測）：探索翻譯重編程與代謝適應。

這種多維整合策略為解析神經疾病的復雜機制提供了系統視角。

文獻案例：破解脆性X綜合征蛋白的翻譯調控密碼，揭示YTHDF1調控mRNA翻譯過程的“開關"—FMRP磷酸化

文章標題：FMRP phosphorylation modulates neuronal translation through YTHDF1

研究背景：脆性X染色體綜合癥（FragileXsyndrome，FXS）是常見的遺傳性智力障礙疾病。FXS的病因主要是編碼脆性X染色體智力低下蛋白（FMRP）的FMR1基因5’端非翻譯區CGG重復片段的增多，導致FMR1基因沉默。FXS的重要特征之一是大腦中非正常活躍的mRNA翻譯。FMRP通常被認為是mRNA翻譯的抑制因子。

該研究闡明了一條在神經元細胞內YTHDF1翻譯功能受FMRP磷酸化調控的路徑，發現了YTHDF1可作為治療FXS的潛在藥物靶標，并揭示了中藥丹參重要成分丹酚酸C（SalvianolicacidC，SAC）可通過抑制YTHDF1，進而緩解FXS疾病癥狀的新策略。

研究發現：

研究結論：?FMRP缺失→YTHDF1持續激活→阻斷YTHDF1-mRNA互作（m6A?基因TE↑）→翻譯抑制→突觸可塑性失衡→脆性X綜合征表型。

該研究揭示了FMRP磷酸化作為“翻譯開關"通過調控m6A“閱讀子"YTHDF1功能影響突觸可塑性的機制，同時表征了YTHDF1相分離相關的相互作用蛋白，提出YTHDF1與核糖體相互作用并且形成翻譯活性高的凝聚體。通過發現的這一調控路徑，他們指出YTHDF1是FXS里的一個新的藥物靶點，并且表征了一個YTHDF1特異性的小分子抑制劑。這為進一步理解YTHDF1在不同生物學系統中的功能調控以及FXS的藥物研發提供了新的方向和分子基礎。

結語

以上就是Ribo-seq在神經科學方向的應用介紹。通過梳理這些研究案例，我們不難發現Ribo-seq在神經科學中已形成成熟研究范式，從翻譯效率動態量化到跨組學機制整合。熟悉Ribo-seq技術的伙伴們，可以充分借鑒這些成熟的研究范式和分析策略，應用于自己的研究項目中。

參考文獻：

1. Dagar S, Sharma M, Tsaprailis G, Tapia CS, Crynen G, Joshi PS, Shahani N, Subramaniam S. Ribosome Profiling and Mass Spectrometry Reveal Widespread Mitochondrial Translation Defects in a Striatal Cell Model of Huntington Disease. Mol Cell Proteomics. 2024 Apr;23(4):100746.

2. Kiltschewskij DJ, Geaghan MP, Cairns MJ. Characterising the Transcriptional and Translational Impact of the Schizophrenia-Associated miR-1271-5p in Neuronal Cells. Cells. 2020 Apr 18;9(4):1014.

3. Duffy EE, Finander B, Choi G, Carter AC, Pritisanac I, Alam A, Luria V, Karger A, Phu W, Sherman MA, Assad EG, Pajarillo N, Khitun A, Crouch EE, Ganesh S, Chen J, Berger B, Sestan N, O'Donnell-Luria A, Huang EJ, Griffith EC, Forman-Kay JD, Moses AM, Kalish BT, Greenberg ME. Developmental dynamics of RNA translation in the human brain. Nat Neurosci. 2022 Oct;25(10):1353-1365.

4. Zou Z, Wei J, Chen Y, Kang Y, Shi H, Yang F, Shi Z, Chen S, Zhou Y, Sepich-Poore C, Zhuang X, Zhou X, Jiang H, Wen Z, Jin P, Luo C, He C. FMRP phosphorylation modulates neuronal translation through YTHDF1. Mol Cell. 2023 Dec 7;83(23):4304-4317.e8.